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紫苏醇（Perillyl Alcohol）是一款广泛应用于癌症治疗的药物，因其抑制肿瘤细胞生长的独特机制备受关注。然而，紫苏醇的产业化生产长期受限于两个“卡脖子”难题：一是需要添加价格高昂的柠檬烯或松节油作为前体，二是微生物合成效率低下导致成本难以控制。

近期，江南大学团队在 ACS Synthetic Biology 发表题为“Engineering Escherichia coli for Perillyl Alcohol Production with Reduced Endogenous Dehydrogenation”的突破性研究，通过对大肠杆菌进行系统性工程改造，首次实现从葡萄糖到紫苏醇的高效合成，摇瓶产量达到 309.1 mg/L，创下摇瓶系统的最高产量纪录。

江大团队此次突破的核心，在于构建了一条从葡萄糖到紫苏醇的“全自主”合成路径——大肠杆菌不仅能自主生成柠檬烯前体，还能通过优化后的柠檬烯羟化酶（Cyp450）直接完成羟基化反应。

紫苏醇的合成需经过前体物质柠檬烯的转化。研究团队首先构建了包含柠檬烯合酶在内的 8 种酶的甲羟戊酸（MVA）代谢路径，将葡萄糖转化为柠檬烯，并对比了不同植物来源的柠檬烯合酶的效率。结果发现，来自柠檬（Citrus limon）的柠檬烯合酶在摇瓶中产生了 52.23mg/L 的柠檬烯。后续均使用该菌株进行柠檬烯的合成。

进一步研究发现，植物酶 N 端的信号肽会在大肠杆菌中引发错误折叠，团队通过精准截短 7 个氨基酸残基，成功使柠檬烯产量提升至 139.91 mg/L，比未截短菌株提高了 1.8 倍。

图 | 工程大肠杆菌中葡萄糖生物合成柠檬烯和紫苏醇的代谢途径

为进一步突破瓶颈，团队采用核糖体结合位点（RBS）工程优化翻译效率，并通过模块化设计将代谢路径分为上游、中游、下游三个独立单元。上游模块包括基因 mvaE 和 mvaS，这些基因参与甲羟戊酸（MVA）途径的前体供应；中游模块包含 mvK、pmK、mvaD 和 Idi 基因，负责将前体转化为异戊烯二磷酸（IPP）和二甲烯丙基二磷酸（DMAPP）；下游模块则由 NPP 和 Ls 基因组成，负责将 IPP 和 DMAPP 转化为柠檬烯。其中，下游模块在 Ls 的 N 端添加 Cm29 标签，增强酶稳定性，使柠檬烯产量从300.85 mg/L 跃升至 417.04 mg/L，较初始菌株提升近 8 倍，为后续紫苏醇合成奠定基础。

图 | 柠檬烯代谢途径的模块化

将柠檬烯转化为紫苏醇的关键在于细胞色素 P450 酶。在 Cyp450 系统中，三种主要蛋白质 Fdx、Fdr 和 P450 酶在电子传递过程中相互作用，从而使 P450 酶完成催化作用。团队发现，过表达Fdx可使紫苏醇产量从 56.54 mg/L 提升至 117.58 mg/L。团队结合两相发酵技术，添加 10% DINP 溶剂捕获产物，产量进一步增至 173.6 mg/L。这一发现揭示了电子传递效率是限制 P450 催化活性的关键因素。

研究过程中，团队意外发现目标产物紫苏醇会被大肠杆菌内源性乙醇脱氢酶 yqhD 进一步氧化为无用副产物紫苏醛。通过基因敲除实验，yqhD 缺陷菌株的紫苏醇产量提升 31%，副产物减少过半。酶动力学分析显示，yqhD 对紫苏醇的催化效率远超普通醇类底物，这解释了其强效氧化能力。

在摇瓶实验中，葡萄糖浓度为 10 g/L 时，紫苏醇的滴度为 186.1 mg/L。随着葡萄糖浓度的增加，紫苏醇的滴度进一步提高，在葡萄糖浓度为 15 g/L 时，滴度最高，为 309.1 mg/L。然而，在葡萄糖浓度为 20 g/L 时，滴度下降至 208 mg/L。这提示细胞在碳源过载时可能出现代谢压力或副产物累积。

团队更值得关注的是工艺的稳定性创新：传统生物合成中，挥发性柠檬烯在转化前常因蒸发损失 30%-50%，而本研究采用两相发酵技术，通过添加 10% 的 DINP 溶剂层实时捕获产物，使紫苏醇回收率提升至 92%。此外，团队通过代谢模型预测发现，当前体系中仍有 38% 的碳通量流向非目标产物，这为后续迭代优化指明了方向。

参考链接：

1.Hao, Y., Liu, M., Fordjour, E. et al. Engineering Escherichia coli for Perillyl Alcohol Production with Reduced Endogenous Dehydrogenation.ACS Synthetic Biology Article ASAP.DOI: 10.1021/acssynbio.4c00854

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