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随着全球对可持续蛋白质需求的激增，精准发酵技术凭借其高效、低碳的特性成为食品工业的焦点。这种技术通过微生物“细胞工厂”高效生产动物蛋白，不仅能大幅减少土地使用和碳排放，还能避免伦理争议。然而，作为常用宿主的丝状真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）却存在一个长期痛点：天然菌株可能产生黄曲霉毒素等致癌物，威胁食品安全。

丹麦生物技术公司 21st.BIO 近日在 Applied Microbiology and Biotechnology 期刊上发表突破性研究“Mycotoxin-free Aspergillus oryzae strain lineage for alternative and novel protein production at industrial scale”，宣布通过基因编辑与发酵工艺优化，成功开发全球首个完全无霉菌毒素的米曲霉菌株系，为食品蛋白生产树立了新的安全标杆。

米曲霉的毒素风险主要源于其基因组中潜藏的四大代谢路径：黄曲霉毒素（AFL）、环匹阿尼酸（CPA）、3-硝基丙酸（3-NPA）以及青霉素G。21st.BIO 的研究团队通过多轮基因编辑，对这些关键区域进行了精准删除。

图 | 环匹安酸(CPA)、黄曲霉毒素(如黄曲霉毒素B1)和 3-硝基丙酸(3-NPA)

首先，针对黄曲霉毒素和环匹阿尼酸，团队发现两者的合成基因簇紧密相邻，位于米曲霉染色体 3 的末端区域。通过对历史菌株 BECh1 的基因组分析，确认该区域存在一段大规模缺失，彻底移除了包含 affR（调控基因）和 cpaA（合成酶基因）在内的毒素合成关键基因。

紧接着，团队将目光转向 3-硝基丙酸（3-NPA）。这种神经毒素的合成依赖于基因 npaA（编码胺氧化酶）和 npaB（编码脱羧酶）。最新研究表明，这两个基因位于染色体 6 上一段 390 kb 的区域内。通过对高产菌株 JaL815 的基因组测序，团队发现该区域已在早期诱变筛选中意外删除，移除了包括 npaA、npaB 在内的 108 个基因。这一“无心插柳”的发现，使得菌株彻底丧失了 3-NPA 合成能力。

为确保万无一失，团队还删除了染色体 6 上的青霉素 G 合成基因簇（acvA、ipnA、aatA），杜绝了抗生素残留风险。经基因组比对，所有删除区域均未涉及核心生长基因，且冗余代谢路径的清除反而提升了菌株的蛋白表达效率。

基因编辑的成果需经严格验证。在实验室中，团队模拟了极端培养条件如营养胁迫、高温，诱导潜在毒素合成。结果显示编辑后的菌株未检出任何黄曲霉毒素、3-NPA 或青霉素。尤为关键的是，环匹阿尼酸的检测依赖其与铁离子形成的红色复合物，而优化后的菌株在固体培养基中始终呈现白色菌落，直观印证了毒素合成的缺失。

图 | 优化菌株（AT604 衍生）在最小固体培养基上的生长速度显著快于野生型 A1560 菌株

菌株的安全性并非仅依赖实验数据。其原始亲本菌株 A1560/IFO 4177 源自传统日本酒曲，已有数十年工业应用历史。在此基础上衍生的菌株系（如 BECh2、AT604）已生产出十余种食品酶，包括脂肪酶、淀粉酶等，均通过欧洲食品安全局（EFSA）与美国 FDA 的严格审批。例如，磷脂酶 A1（GRN 811）与葡萄糖氧化酶（GRN 106）等产品，早在 2000 年代初便获 GRAS 认证，累计安全使用记录超过 20 年。

性能优化是工业化落地的另一关键。尽管编辑菌株在固体培养基中生长稍慢于野生菌株，但其在液态发酵中的表现截然不同，蛋白产量提升 30% 以上，且发酵液粘度降低 40%，大幅简化了后续纯化步骤。以牛 β-乳球蛋白（BLG）为例，采用该菌株生产的重组蛋白已通过美国 FDA 的 GRAS 认证，从实验室到中试生产的周期缩短至 18 个月，成本降低近 40%。

米曲霉的天然特性使其在工业发酵中独具优势。与酵母和细菌相比，其蛋白表达量更高，且能高效利用甘蔗渣、玉米秸秆等廉价农业废料作为碳源，进一步降低生产成本。此外，米曲霉分泌的宿主蛋白较少，减少了纯化难度，使其尤其适合生产高纯度食品成分。

目前，21st.BIO 已将该菌株技术应用于多个合作项目。除 BLG 外，乳清蛋白、卵黏蛋白等产品已进入商业化准备阶段。更复杂的酪蛋白合成也取得突破，预计未来两年内推出首款全素奶酪。在非食品领域，该菌株还被用于生产生物降解材料的前体分子，展现了跨行业的应用潜力。

尽管美国市场进展迅速，欧洲的审批壁垒仍待突破。欧盟现行的“质量安全推定（QPS）”制度仅针对细菌和酵母，且以物种为单位评估，无法体现基因编辑菌株的特异性安全。21st.BIO 联合多位学者呼吁欧盟引入“菌株级 QPS”，基于基因组数据与长期安全记录简化审批流程。这一改革意义重大——若成功，欧洲企业可将新型蛋白产品的上市周期缩短至 1-2 年，加速替代蛋白的普及。此外，随着 CRISPR 等基因编辑技术的成熟，未来或能实现更复杂的代谢路径设计，例如合成植物中稀有的功能性蛋白，进一步拓展精准发酵的边界。

参考链接：

1.Lehmbeck, J., Andersen, B., Sáez-Sáez, J. et al. Mycotoxin-free Aspergillus oryzae strain lineage for alternative and novel protein production at industrial scale. Appl Microbiol Biotechnol 109, 94 (2025). https://doi.org/10.1007/s00253-025-13482-6

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