公司新闻

天然酶是一类具有卓越多功能性、高选择性和超高效率的生物催化剂。然而要让计算设计的酶（尤其是针对非天然反应的酶）达到这种催化水平仍面临巨大挑战。

Kemp 消除反应是一种经典的有机化学反应，涉及苯并异噁唑（benzisoxazole）类化合物在碱性条件下的开环反应。因自然界尚未发现其专属天然酶，Kemp 消除反应长期以来被用作研究从头酶设计的模型系统。尽管蛋白质设计方法日益精进，计算设计的 Kemp 消除酶仍表现出较低的催化效率与速率。

近日，来自魏茨曼科学研究所的 Sarel Fleishman 团队开发了一套完整的计算流程，成功设计了高效的 Kemp 消除酶。其中，最高效酶与其最接近的天然酶相差超过 140 个氨基酸，其效率也比之前使用人工智能设计的类似酶高出 100 倍。相关研究以题为“Complete computational design of high-efficiency Kemp elimination enzymes”发表在 Nature 期刊。

关于从头设计酶效率低下的根本原因已有深入研究，包括活性位点结构畸变、稳定性与可表达性不足、固定骨架设计方法的局限性、过渡态（理论酶）的不确定性、忽略蛋白质动态与长程相互作用等。

因此，研究人员假设，有效的酶设计必须全面控制蛋白质的所有自由度，以确保稳定性、可折叠性以及理论催化构型（theozyme）的精准定位。

他们选择 TIM 桶状折叠作为设计框架——这是酶中最常见的结构之一。该折叠中，中心 β 桶的残基朝向活性位点空腔排列，为催化基团和底物结合基团的优化布局提供了丰富可能；并开发了一种普适性计算方法，只要给定预计算的理论催化构型，即可应用于任意反应。

工作流程如下：骨架生成，通过同源蛋白片段的组合装配与设计，生成数千种骨架变体，使活性位点区域呈现骨架多样性；稳定性优化，应用 PROSS（Protein Repair One Stop Shop）计算稳定设计构象；活性位点设计，通过几何匹配将 KE 理论催化构型定位至每个骨架，并利用 Rosetta 原子级计算优化活性位点（包括突变天然酶遗留的催化残基）；全局稳定化，采用模糊逻辑优化目标函数平衡冲突指标（如系统低能量与催化碱基的高去溶剂化），筛选出数十个最优设计后，进一步稳定活性位点及蛋白质核心区，最终设计产物与任何天然蛋白的差异突变超过 100 处。

图 | 设计工作流程中的关键步骤

为验证上述方法，研究人员将该流程应用于吲哚-3-甘油-磷酸合酶 (IGPS) 酶家族，该家族可以在空间上容纳 5-硝基苯并异噁唑底物，并且之前曾用于设计 Kemp 消除酶。

实验测试了 73 种设计，其长度介于 245-268 个氨基酸，序列多样性显著（彼此间相似度 30-93%，与任何天然蛋白相似度 41-59%）。总共有 66 个设计实现了可溶性表达，其中 14 个设计表现出协同热变性，3 种设计在初步筛选中表现出可测量的 KE 活性，最优设计 Des27 和 Des61 的 Kcat / Km 值分别为 130 和 210 M⁻¹s⁻¹。催化效率与早期计算设计酶相当，但仍比实验室进化优化的设计酶低数个数量级。

为了进一步提升酶活性，研究人员通过 FuncLib 模拟的靶向诱变，从 Des61 和 Des27 分别筛选出 6 种和 12 种设计（各含 5-8 个突变）。

其中，基于 Des61 的优化设计催化效率达 3600 M⁻¹s⁻¹；基于 Des27 的 8 种设计催化速率提升 10-70 倍，最优变体 Des27.7（含 7 个突变）的催化效率达 12,700 M⁻¹s⁻¹，较此前所有计算设计高一个数量级。此外，Des27.7 与天然 IGPS 差异显著，与非冗余数据库中最接近的蛋白相比存在 141 个突变及多处插入/缺失，其序列、骨架及活性位点构型均不同于以往基于天然 IGPS 骨架的设计。

该计算流程整合了多个设计模块，每个模块通过引入突变分别解决高效生物催化的关键问题，如骨架多样性、稳定性、可折叠性和活性。

为检验模块化组装对生成多样骨架的作用，研究人员又对 1,072 个 AlphaFold2 预测的 IGPS 结构应用后续流程。测试的 55 种设计中：49 种（89%）可溶性表达，28 种（50%）呈现协同变性；其中 20 种（70%）具有可测 KE 活性，证明该流程可从不同起点设计稳定且功能性的 Kemp 消除酶。

对 6 种设计的活性位点应用 FuncLib 后，5 种设计的催化效率提升 3–10 倍。两种设计的晶体结构（R2.Des39 和 Des49）显示活性位点与设计模型接近，但部分环区因构象变化或电子密度缺失可能阻碍底物进入。通过 FuncLib 稳定这些区域后，16 种变体中有 3 种催化效率提升最高 20 倍，但仍未超越 Des27.7。

为解析 Des27.7 高稳定性和活性的成因，研究人员拆解了各设计模块的贡献：仅模块化组装设计（含 92 个突变）：Tm 57°C，无 KE 活性；添加 PROSS 稳定性突变（11个突变）：表达量和稳定性显著提升（Tm 69°C）；仅嫁接活性位点设计（15个突变）：活性达 2,900 M⁻¹s⁻¹，但比 Des27.7 低 4 倍；组合所有模块：稳定性和活性协同提升，突破单一模块的累加效应。

图 | 解析 Des27.7 高稳定性和活性的成因

这一结果打破了实验室进化中常见的稳定性-活性权衡现象，且活性位点突变反而增强了稳定性，凸显了全局稳定化对高效酶设计的重要性。

此外，研究人员对理论催化残基的作用进行了验证。催化碱基 Asp162 突变为 Ala 后活性完全丧失；芳香残基 Phe113 突变为 Met 时活性相当，而突变为 Leu 时催化效率跃升一个数量级催化效率达到 123,000 M⁻¹s⁻¹，催化速率也大幅提升，超越近期 AI 设计酶两个数量级。

值得注意的是，该团队的合成蛋白质比许多天然存在的酶要简单得多，天然酶可以经历复杂的结构变化，从而催化多步骤的化学反应。Fleishman 表示，他和同事目前正在测试他们的系统是否能够提高一种名为 Rubisco 的酶的效率，后者对光合作用至关重要。

参考链接：

1. Listov, D., Vos, E., Hoffka, G. et al. Complete computational design of high-efficiency Kemp elimination enzymes. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09136-2

2. https://www.nature.com/articles/d41586-025-01897-0#ref-CR1

免责声明：本文旨在传递合成生物学最新讯息，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。